Der neunmalige Weltmeister fuhr mit seiner Yamaha auf dem 5,2 km langen Kurs nördlich von Florenz in 1:46,504 Minuten die beste Zeit und verwies seinen künftigen Teamkollegen Maverick Vinalesauf Platz zwei.
Weltmeister Jorge Lorenzo kam nur auf Platz fünf. Aprilia-Pilot Stefan Bradl fuhr eine 1:48,646 und startet am Sonntag von Platz 20.
Moto2-Pilot Jonas Folger, der in der kommenden Saison in die MotoGP wechselt, qualifizierte sich auf seiner Kalex nur für Rang 17. Marcel Schrötter fuhr auf einen starken fünften Platz, Sandro Cortese wurde Elfter. Die Pole Position ging an den Briten Sam Lowes.
In der Moto3 sicherte sich der Italiener Romano Fenati die Pole. Philipp Öttl hatte sich beim vergangenen Rennen in Le Mans die Hand gebrochen und ist in Mugello nicht am Start.